Infatti, negli organismi superiori, inclusi gli essere umani, le rotture del DNA possono essere riparate attraverso diversi meccanismi sofisticati di riparazione [6-7]. Il più frequente di questi meccanismi è chiamato non-homologous end joining (NHEJ). In conseguenza del danno ad una sequenza di DNA, questo sistema di riparazione effettua l’inserzione o la delezione di piccoli pezzi di DNA in prossimità del sito di rottura, allo scopo di ricostruire la sequenza danneggiata. Tuttavia, questo meccanismo commette spesso errori e l’inserzione, come anche la delezione, di piccoli pezzi di DNA può comportare il cambiamento radicale della sequenza originale di DNA [8].

I ricercatori sfruttano gli errori che si verificano durante la riparazione del DNA per riuscire ad annullare l’espressione di uno specifico gene. Infatti, mutazioni casuali derivanti dal processo di riparazioni esitano in un gene non funzionante e, pertanto, in una proteina non funzionante. L’eliminazione di un gene è molto utile per riuscire a comprenderne la funzione, in particolare valutando gli effetti biologici derivanti proprio dalla sua eliminazione. Rendere un gene non funzionante permette di scoprire in quale via di segnalazione è coinvolto, oppure è utile per creare modelli di malattia che possano essere utilizzati per testare nuovi approcci terapeutici. Tuttavia, la casualità con cui NHEJ modifica la sequenza di DNA rende poco controllabile il processo di editing genetico. In particolare, questo sistema non può essere usato per correggere un gene che causa una patologia, ristabilendo la sua funzione, né può essere usato per conferire nuove caratteristiche vantaggiose alla cellula manipolata.

Per superare queste limitazioni, gli scienziati sfruttano un secondo, seppur meno frequente sistema di riparazione basato sulla ricombinazione omologa. La ricombinazione omologa è un processo molecolare che garantisce una riparazione altamente fedele, attraverso lo scambio di informazioni tra due molecole simili di DNA. Quando si verifica una rottura nella doppia elica di DNA, una molecola di DNA intatta ed identica a quella danneggiata viene utilizzata dalla cellula per sostituirla.

Sfruttando lo stesso principio, i ricercatori sono in grado di introdurre una nuova sequenza all’interno del genoma della cellula ospite in modo estremamente semplice:

1. Il complesso Cas9/gRNA viene introdotto all’interno del nucleo della cellula affinché tagli una specifica sequenza di DNA genomico;
2. I ricercatori introducono anche una molecola di DNA con la funzione di templato, che contiene le modifiche che vogliono conferire alla sequenza originale;
3. La rottura causata da Cas9 viene riparata mediante ricombinazione omologa tra la sequenza originale ed il templato; in altre parole, la cellula viene ingannata a riparare il proprio stesso genoma con la modificazione scelta dai ricercatori [9-10].

Per concludere, CRISPR/Cas9 rappresenta un interessante esempio di come gli scienziati siano riusciti a realizzare una tecnica di ingegneria genetica, combinando insieme un piccolo sistema di difesa delle cellule procariotiche ed i più sofisticati meccanismi di riparazione del DNA delle cellule eucariotiche. Questo ha aperto le porte alla realizzazione di nuove strategie terapeutiche per il trattamento delle malattie genetiche, dei tumori e molte altre. Tuttavia, malgrado il suo indubbio potenziale, i ricercatori hanno dovuto affrontare numerosi problemi derivanti dall’applicazione della tecnologia basata su CRISPR/Cas9.

Nel prossimo articolo della serie, discuteremo i principali problemi tecnici di CRISPR/Cas9, come gli eventi off-target, e scopriremo come gli scienziati hanno proposto soluzioni a queste limitazioni, migliorando il sistema ed accorciando i tempi per l’utilizzo in sicurezza nell’uomo di questa tecnologia.