Seria CRISPR/Cas9: fascynująca podróż od prymitywnego systemu obronnego bakterii do zaawansowanej technologii edycji ludzkich genów.
Mechanizmy naprawy DNA jako klucz do inżynierii ludzkich genów przy użyciu CRISPR/Cas9
Podsumowanie:
- W 2020 r. w technologii CRISPR/Cas9 dokonał się przełom, który zrewolucjonizował branżę żywieniową i medyczną.
- CRISPR/Cas9 tworzy cięcie w DNA, uruchamiając kilka mechanizmów naprawy komórek, które naukowcy wykorzystują do manipulowania genomem organizmów.
- System naprawy DNA określany jako scalenie niehomologiczne końców DNA (NHEJ) służy do inaktywacji genu w celu zbadania jego funkcji lub stworzenia modelu choroby.
- Naprawa DNA oparta na homologicznej rekombinacji pomaga naukowcom naprawić wadliwy gen lub wstawić nowy, co stanowi potencjalną terapię genową chorób człowieka.
Pomimo obaw wzbudzonych przez pandemię, rok 2020 zostanie najprawdopodobniej również zapamiętany jako przełomowy rok dla technologii CRISPR. Oprócz Nagrody Nobla w dziedzinie chemii przyznanej Emmanuelle Charpentier i Jennifer Doudnie, technologia CRISPR/Cas9 znalazła się w centrum uwagi z innych ekscytujących powodów.
W kwietniu 2020 r. naukowcy z Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis (UC Davis) wyhodowali Cosmo, pierwsze cielę byka poddanego inżynierii genetycznej CRISPR [1]. W grudniu amerykański Departament Rolnictwa (USDA), zgodnie z decyzją Agencji ds. Żywności i Leków (FDA), uregulował stosowanie CRISPR/Cas9 jako nowej metody uzyskiwania genetycznie modyfikowanych upraw [2-3]. Zeszłego lata CRISPR/Cas9 z powodzeniem zastosowano do produkcji zdrowych komórek krwi do leczenia kobiety dotkniętej anemią sierpowatą [4]. Co więcej, kilka miesięcy wcześniej wyniki badania klinicznego na Uniwersytecie Pensylwanii wykazały, że zastosowanie ludzkich limfocytów T opracowanych przy użyciu CRISPR/Cas9 może okazać się skuteczne w leczeniu raka [5].
W naszym poprzednim artykule przedstawiliśmy, w jaki sposób technologia CRISPR/Cas9 wywodzi się z adaptacyjnego układu odpornościowego bakterii i jak działa. CRISPR/Cas9 to kompleks składający się z białka (Cas9) i naprowadzających molekuł RNA (gRNA), które są w stanie rozpoznać określoną sekwencję DNA i stworzyć w niej cięcie. W tym artykule omawiamy dlaczego możliwość precyzyjnego cięcia DNA jest kluczowa dla naukowców i jak to odkrycie zapoczątkowało rewolucję genetyczną, której jesteśmy świadkami.
Pęknięcia DNA są naturalnym zjawiskiem w wielu organizmach. Fizjologiczne pęknięcia DNA mogą, na przykład, wystąpić podczas podziału komórkowego, aby ułatwić wymianę DNA między parami chromosomów. Co więcej, bodźce zewnętrzne, takie jak promieniowanie UV i środki chemiczne, mogą powodować uszkodzenie DNA komórek, które normalnie zawierają jedno lub więcej pęknięć podwójnej helisy. Aby przetrwać, komórki muszą naprawiać uszkodzenia DNA, gdy tylko te się pojawią. Analogicznie, cięcie Cas9 skutkuje ukierunkowanym pęknięciem DNA określonej sekwencji, którą naukowcy chcą edytować, wykorzystując mechanizmy naprawy komórek.
W rzeczywistości, w organizmach wyższych, w tym u ludzi, pęknięcia DNA można naprawić za pomocą kilku wyrafinowanych mechanizmów [6-7]. Najczęstszy z tych mechanizmów określa się mianem 'naprawa poprzez scalanie niehomologicznych końców DNA’. W wyniku uszkodzenia sekwencji DNA, system ten wstawia lub usuwa małe fragmenty DNA w miejscu pęknięcia aby odtworzyć uszkodzoną sekwencję. Mechanizm ten jest jednak wysoce podatny na błędy i po losowej insercji lub delecji małych fragmentów DNA może skutkować dramatycznymi zmianami oryginalnej sekwencji DNA [8].
Badacze wykorzystują błędy występujące podczas naprawy DNA w celu anulowania ekspresji określonego genu. W rzeczywistości, losowe mutacje często skutkują niedziałającym genem, a następnie niedziałającym białkiem. Usunięcie genów jest bardzo pomocne w badaniu biologicznych skutków ich usunięcia, badaniu szlaku sygnałowego lub tworzeniu modeli chorób w celu przetestowania nowych metod terapeutycznych. Losowość zmian wprowadzanych przez scalanie niehomologicznych końców DNA pozwala jednak naukowcom na ograniczoną kontrolę nad edycją genów. W szczególności, system ten nie może być wykorzystany do skorygowania genu wywołującego chorobę poprzez przywrócenie jego funkcji lub nadania nowych korzystnych cech manipulowanym komórkom [9].
Aby przezwyciężyć te ograniczenia, naukowcy wykorzystują inny, rzadszy system naprawy, który oparty jest na rekombinacji homologicznej. Rekombinacja homologiczna to proces molekularny zapewniający naprawę o wysokiej efektywności, w której informacja genetyczna jest wymieniana między dwiema podobnymi cząsteczkami DNA. Gdy nastąpi przecięcie genomowego DNA, komórki wykorzystują nienaruszoną identyczną cząsteczkę DNA, aby zastąpić te uszkodzone.
Korzystając z tej zasady, naukowcy są w stanie wprowadzić nową sekwencję do genomu komórki gospodarza w następujący sposób:
- Kompleks Cas9/gRNA wprowadza się do jąder komórkowych w celu przecięcia określonej sekwencji genomowego DNA;
- Naukowcy wprowadzają również cząsteczkę DNA jako matrycę homologiczną, zawierającą modyfikacje, które chcą wprowadzić;
- Uszkodzenie DNA za pomocą Cas9 jest naprawiane przez homologiczną rekombinację wprowadzonej matrycy DNA; innymi słowy, komórki są nakłaniane do naprawy własnego genomu z wybranymi modyfikacjami [9-10].
Podsumowując, CRISPR/Cas9 stanowi intrygujący przykład tego, jak naukowcy wynaleźli narzędzie do edycji genomu łącząc niewielki prokariotyczny mechanizm obronny z mechanizmami naprawy eukariotycznego DNA. Otworzyło to drzwi do strategii terapeutycznych nowej generacji w leczeniu chorób genetycznych, raka i wielu innych. Jednakże, pomimo fascynującego potencjału CRISPR/Cas9, badacze stanęli przed dalszymi wyzwaniami związanymi z zastosowaniem tej technologii.
W następnym artykule z tej serii zajmiemy się głównymi wadami technicznymi zestawu narzędzi CRISPR/Cas9, np. wiązanie się do nieprawidłowego celu, i odkryjemy w jaki sposób naukowcy rozwiązali te problemy i przystosowali system do leczenia organizmu ludzkiego.
Bibliografia:
- https://ucdavis.app.box.com/s/cpipr5wwnrdr69k7s46l81kbtmzycfg7/file/694452573988
- https://www.aphis.usda.gov/brs/pdf/aphis-2020-0079.pdf
- https://www.fda.gov/media/74614/download
- https://www.npr.org/sections/health-shots/2020/12/15/944184405/1st-patients-to-get-crispr-gene-editing-treatment-continue-to-thrive
- https://science.sciencemag.org/content/367/6481/eaba7365
- Liang F, Han M, Romanienko P.J., & Jasin M. Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences, 95(9), 5172-5177 (1998)
- Ranjha, L., Howard, S. M., and Cejka, P. (2018). Main steps in DNA double-strand break repair: an introduction to homologous recombination and related processes. Chromosoma 127, 187–214. doi: 10.1007/s00412-017-0658-1
- Bothmer, A. et al. Characterization of the interplay between DNA repair and CRISPR/Cas9-induced DNA lesions at an endogenous locus. Nat. Commun. 8, 13905 (2017).
- Sonoda E, Hochegger H, Saberi A, Taniguchi Y, Takeda S. Differential usage of non-homologous end-joining and homologous recombination in double strand break repair. DNA Repair (Amst) 2006; 5: 1021–1029.
- Horii, Takuro, and Izuho Hatada. “Challenges to increasing targeting efficiency in genome engineering.” The Journal of reproduction and development vol. 62,1 (2016): 7-9. doi:10.1262/jrd.2015-151