Série CRISPR/Cas9: uma viagem fascinante do sistema de defesa duma bactéria primitiva até uma tecnologia avançada de edição de genes humanos.
Os mecanismos de reparação de ADN como chave para a engenharia de genes humanos com CRISPR/Cas9
Resumo:
- Em 2020, a tecnologia CRISPR/Cas9 alcançou vários avanços que estão a revolucionar os campos da alimentação e da medicina.
- O CRISPR/Cas9 faz uma ruptura no DNA, desencadeando vários mecanismos de reparação celular que os investigadores exploram para manipular o genoma dos organismos.
- O sistema de reparação de ADN referido como Junção final não-homóloga (NHEJ) é utilizado para inativar um gene, a fim de investigar a sua função ou criar modelos de doença.
- A reparação de ADN baseada na recombinação homóloga ajuda os investigadores a reparar um gene defeituoso ou a inserir um novo gene, como potencial terapia genética para doenças humanas.
Apesar das preocupações sobre a pandemia global, 2020 será muito provavelmente também recordado como o ano chave do CRISPR. Para além do Prémio Nobel da Química atribuído a Emmanuelle Charpentier e Jennifer Doudna, a tecnologia CRISPR/Cas9 tem estado sob as luzes da ribalta por outras razões emocionantes.
Em Abril de 2020, cientistas da Universidade da Califórnia, Davis (UC Davis) criaram o Cosmo, o primeiro bezerro de touro geneticamente modificado via CRISPR [1]. Em Dezembro, o Departamento de Agricultura dos EUA (USDA), em seguimento da decisão da Administração de Alimentos e Drogas (FDA), regulamentou a utilização do CRISPR/Cas9 como um novo método para a obtenção de culturas geneticamente modificadas [2-3]. No Verão passado, o CRISPR/Cas9 foi utilizado com sucesso para produzir células sanguíneas saudáveis para tratar uma mulher afetada por anemia falciforme [4]. Além disso, alguns meses antes, os resultados de um ensaio clínico na Universidade da Pensilvânia demonstraram que a utilização de linfócitos T humanos concebidos pelo CRISPR/Cas9 poderia ser viável para a terapia do cancro [5].
No nosso artigo anterior, apresentámos como a tecnologia CRISPR/Cas9 era derivada do sistema imunitário adaptativo de bactérias e como funciona. O CRISPR/Cas9 é um complexo formado por uma proteína (Cas9) e um RNA guia (gRNA) que é capaz de reconhecer uma sequência específica de ADN e criar uma ruptura dentro dela. Neste artigo, abordamos a razão pela qual ser capaz de cortar o ADN com precisão é crucial para os investigadores e como isto iniciou a revolução a que estamos a assistir no campo da engenharia genética.
As quebras de ADN são um fenómeno natural em muitos organismos. Por exemplo, as quebras de ADN fisiológicas podem ocorrer durante a divisão celular para facilitar a troca de ADN entre os pares de cromossomas. Além disso, estímulos externos, tais como radiação UV e agentes químicos, podem causar danos no ADN das células, que normalmente consistem em uma ou mais quebras da dupla hélice. A fim de sobreviver, é imperativo que as células reparem as lesões de ADN sempre que estas ocorram. Analogamente, o corte Cas9 resulta numa quebra de ADN direccionada para uma sequência específica que os cientistas querem editar, tirando partido dos mecanismos de reparação celular.
De facto, em organismos superiores, incluindo humanos, as quebras de ADN podem ser recuperadas por vários mecanismos sofisticados de reparação [6-7]. O mais frequente destes mecanismos é referido como junção final não-homóloga (NHEJ). Como resultado de danos nas sequências de ADN, este sistema de reparação insere ou apaga pequenos pedaços de ADN no local de quebra para reconstruir a sequência danificada. No entanto, este mecanismo é altamente propenso a erros e após inserção aleatória, tal como eliminação de pequenas peças de ADN poderá resultar em mudanças dramáticas da sequência original de ADN [8].
Os investigadores tiram partido dos erros que ocorrem durante a reparação do ADN, a fim de comprometer a expressão de um gene específico. De facto, as mutações aleatórias resultam frequentemente num gene que não funciona, e depois numa proteína que não funciona. A deleção de genes é muito útil para investigar os efeitos biológicos da sua remoção, para estudar uma via de sinalização ou para criar modelos de doença para testar novas abordagens terapêuticas. No entanto, a aleatoriedade das alterações introduzidas pela NHEJ permite pouco controlo na edição de genes por parte dos investigadores. Em particular, este sistema não pode ser utilizado para corrigir um gene que causa uma doença, restabelecendo a sua função, ou para dar novas características vantajosas às células manipuladas [9].
Para ultrapassar tais limitações, os cientistas exploram um segundo sistema de reparação, menos frequente, baseado na recombinação homóloga. A recombinação homóloga é um processo molecular que proporciona uma reparação de alta fidelidade em que a informação genética é trocada entre duas moléculas semelhantes de ADN. Quando ocorre uma quebra no DNA genómico, as células utilizam uma molécula idêntica intacta de DNA para substituir as danificadas.
Usando este princípio, os investigadores são capazes de introduzir uma nova sequência no genoma de uma célula hospedeira de uma forma bastante simples:
- O complexo Cas9/gRNA é introduzido nos núcleos celulares para cortar uma sequência específica de ADN genómico;
- Os investigadores introduzem também uma molécula de ADN como modelo homólogo, contendo as modificações que pretendem introduzir;
- A quebra induzida pela Cas9 é reparada por recombinação homóloga do modelo de ADN introduzido; por outras palavras, as células são enganadas para reparar o seu próprio genoma com as modificações escolhidas [9-10].
Conclusivamente, o CRISPR/Cas9 representa um exemplo intrigante de como os cientistas inventaram uma ferramenta de edição de genoma ao combinar um pequeno mecanismo de defesa procariótica e os mecanismos de reparação do ADN eucariótico. Isto abriu a porta à proposta da próxima geração de estratégias terapêuticas para o tratamento de doenças genéticas, cancro e muitas outras. No entanto, apesar do potencial fascinante do CRISPR/Cas9, os investigadores enfrentaram vários desafios na aplicação desta tecnologia.
No próximo artigo desta série, abordaremos os principais inconvenientes técnicos da caixa de ferramentas CRISPR/Cas9, tais como eventos fora do alvo, e descobriremos como os cientistas ultrapassaram estas questões e melhoraram o sistema de aplicação humana.
Referências:
- https://ucdavis.app.box.com/s/cpipr5wwnrdr69k7s46l81kbtmzycfg7/file/694452573988
- https://www.aphis.usda.gov/brs/pdf/aphis-2020-0079.pdf
- https://www.fda.gov/media/74614/download
- https://www.npr.org/sections/health-shots/2020/12/15/944184405/1st-patients-to-get-crispr-gene-editing-treatment-continue-to-thrive
- https://science.sciencemag.org/content/367/6481/eaba7365
- Liang F, Han M, Romanienko P.J., & Jasin M. Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences, 95(9), 5172-5177 (1998)
- Ranjha, L., Howard, S. M., and Cejka, P. (2018). Main steps in DNA double-strand break repair: an introduction to homologous recombination and related processes. Chromosoma 127, 187–214. doi: 10.1007/s00412-017-0658-1
- Bothmer, A. et al. Characterization of the interplay between DNA repair and CRISPR/Cas9-induced DNA lesions at an endogenous locus. Nat. Commun. 8, 13905 (2017).
- Sonoda E, Hochegger H, Saberi A, Taniguchi Y, Takeda S. Differential usage of non-homologous end-joining and homologous recombination in double strand break repair. DNA Repair (Amst) 2006; 5: 1021–1029.
- Horii, Takuro, and Izuho Hatada. “Challenges to increasing targeting efficiency in genome engineering.” The Journal of reproduction and development vol. 62,1 (2016): 7-9. doi:10.1262/jrd.2015-151